cdn文库
定义与构建原理
定义
cDNA文库(cDNA library)是指某生物某一发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合,这种文库特异地反映某种组织或细胞中,在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因。
构建原理
经典cDNA文库构建的基本原理是使用Oligo(dT)作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的cDNA加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得cDNA文库,其基本步骤包括:
1、mRNA的提纯:获取高质量的mRNA是构建高质量cDNA文库的关键步骤之一。
2、cDNA第一条链的合成:通过反转录酶将mRNA转化为cDNA。
3、cDNA第二条链的合成:以第一条cDNA为模板,合成第二条cDNA链。
4、双链cDNA的修饰:对合成的双链cDNA进行修饰,以便后续步骤。
5、双链cDNA的分子克隆:将修饰后的双链cDNA克隆到适当的载体中。
6、cDNA文库的扩增:通过宿主细胞的培养,扩增cDNA文库。
7、cDNA文库鉴定评价:对构建的cDNA文库进行鉴定和评价,确保其质量和代表性。
注意事项
获得起始RNA:构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多,一般推荐采用纯化总mRNA后进行反转录,这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好。
反转录:这是构建cDNA文库中最贵的一步,也是核酸质变的一步,它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA,反转录不成功,说明一次文库方案的夭折。
层析柱cDNA分级:这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。
噬菌体文库或质粒文库:均对载体与cDNA的连接效率要求很高,也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。
应用与优势
cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势,从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值,是研究工作中最常使用到的基因文库。
特征 | 基因组DNA文库 | cDNA文库 |
包含内含子和外显子的基因组基因 | 经过剪接、去除了内含子的cDNA | |
复杂程度 | 真核生物基因组DNA十分庞大,含有大量重复序列 | 由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多 |
筛选目的基因 | 难以直接分离到目的基因 | 比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因 |
cDNA文库是一种重要的生物技术工具,它为研究基因表达和功能提供了宝贵的资源。
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